Détermination par spectroscopie RPE des propriétés rédox d’intermédiaires catalytiques stabilisés par potentiométrie rédox dans le complexe respiratoire nitrate réductase A

Coloration: Biochimie structurale

Responsable du stage :

Dr. Stéphane GRIMALDI, Unité de Bioénergétique et Ingénierie des Protéines (BIP)                                    

Tél : 04 91 16 45 57, email : Cette adresse email est protégée contre les robots des spammeurs, vous devez activer Javascript pour la voir. "> Cette adresse email est protégée contre les robots des spammeurs, vous devez activer Javascript pour la voir.

Lieu du stage :                                     Unité de Bioénergétique et Ingénierie des Protéines (BIP)       

Institut de Microbiologie de la Méditerranée

                                                     Campus CNRS

31, chemin Joseph Aiguier 13009 Marseille

Résumé :

Le stage porte sur l’étude du fonctionnement de la nitrate réductase A (NarGHI) d’Escherichia coli, une enzyme modèle clef de la respiration anaérobie retrouvée dans de nombreux micro-organismes. Cette métalloenzyme membranaire est orientée du côté cytoplasmique. Elle possède plusieurs cofacteurs métalliques qui assurent le transfert d’électrons entre le site d’oxydation des quinols situé dans la sous unité membranaire NarI à la réduction du nitrate en nitrite catalysée par le cofacteur à molybdène situé dans l’une des deux sous-unités cytoplasmiques (NarGH).

La compréhension détaillée du mécanisme enzymatique nécessite l’obtention de données structurales et rédox sur les intermédiaires générés dans les sites actifs de NarGHI au cours de la catalyse, en particulier les radicaux semiquinones ou les espèces Mo(V), détectables par spectroscopie de Résonance Paramagnétique Electronique (RPE). Pour cela, une stratégie de mutagénèse dirigée a été entreprise sur ces deux sites afin de mieux comprendre le rôle de l’environnement protéique dans le réglage fin de la réactivité de NarGHI envers ses substrats. Le travail proposé au stagiaire consistera donc à stabiliser en atmosphère contrôlée des intermédiaires réactionnels par potentiométrie rédox dans les variants déjà générés et à les étudier par spectroscopie RPE afin de caractériser ces intermédiaires, les quantifier et d’élucider leurs propriétés rédox, puis de comparer ces données à celles déjà mesurées dans l’enzyme sauvage. Selon ses gouts et le temps disponible, le stagiaire pourra également participer à la préparation des échantillons (purification de fractions membranaires ou d’enzyme soluble NarGH) et à la caractérisation enzymatique des variants en collaboration avec l’équipe d’Axel Magalon (Laboratoire de Chimie Bactérienne).

Principales techniques utilisées au cours du stage :

- Titrage d’oxydoréduction en boîte à gants

- Spectroscopie RPE en conditions cryogéniques

- Visualisation et analyse (fit) des données à l’aide du logiciel Origin et/ou Matlab

Référence :

S. Grimaldi, B. Schoepp-Cothenet, P. Ceccaldi, B. Guigliarelli & A. Magalon
The prokaryotic Mo/W-bisPGD enzymes family: a catalytic workhorse in bioenergetic
Biochim. Biophys. Acta - Bioenergetics (2013), 1827, 1048-1085